干眼文献01普拉洛芬治疗干眼患者的
作者：陈景尧，董菲，陈蔚，孙旭光，邓应平，洪晶，张明昌，杨文照，刘祖国，谢立信
关键词：干眼；非甾体类抗炎药；炎症；治疗；结膜印迹细胞学检查
背景：干眼是一种泪液和眼表的多因素疾病。本研究的目的在于评价非甾体类抗炎药普拉洛芬治疗干眼的临床疗效。
方法：这是一个前瞻、多中心、随机、对照、平行的研究。名轻中度干眼患者（每治疗组55-60名）参与了本项多中心研究。患者被随机给予0.1%普拉洛芬（PRA）联合0.1%玻璃酸钠（SH）的滴眼液治疗或只给予SH滴眼液治疗，每日3次，共28日，随后进行1个星期的随访。在治疗前和每次回访时，对干眼症状评分（DESS）、角膜荧光素染色（FLCS）、泪膜破裂时间（TBUT）和泪液分泌试验（ST1，无麻醉）进行评价或测量。对用PRA联合SH治疗的患者在治疗前后进行结膜印迹细胞学检查，并进行即时聚合酶链锁反应（RT-PCR）以检测人白细胞抗原DR（HLA-DR）和细胞粘附分子-1（ICAM-1）的变化。
结果：用PRA联合SH治疗的患者在DESS、FLCS、TBUT方面有逐步改善。从第14日，FLCS与TBUT的组间比较具有统计学意义上的差异。在两组均具有良好的耐受性，没有发生严重的副反应。经过28日的治疗，用PRA加SH治疗的患者的HLA-DR表达水平降低，且具有统计学意义上的差异。
结论：对于轻中度干眼患者给予0.1%的PRA具有良好的耐受性和疗效，其作用机制可能与降低结膜上皮细胞的炎症因子相关。
干眼是一种泪液和眼表的多因素疾病，会引起眼部不适、视力障碍和泪膜不稳定等症状，并对眼表有产生潜在损害1。干眼的发病率因种族、环境、遗传背景和生活方式的不同而不同。在美国，干眼的患病率是7.8%-14.6%2,3。流行病学的研究表明，中国某些区域的人口干眼的患病率更高（10%-30%）4,5。
炎症和/或免疫病理学的变化对干眼的发病机理非常重要。这些变化通过引起眼表面及泪腺组织的慢性损伤促进干眼的病程进展，同时进一步加重干眼的症状与体征。干眼患者的感染、机械性损伤或泪液渗透压的增加这些病理因素能够加重免疫细胞侵润以及增加眼表的促炎性细胞因子如IL-1α、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及金属蛋白酶（MMPs）的浓度6-8。这些免疫病理学的变化已经在结膜或泪液中观察到，结膜印迹细胞学检测到的人白细胞抗原DR（HLA-DR）和细胞粘附分子-1（ICAM-1）的表达水平被认为是干眼及其相关炎症的重要标记物9,10。
近年来由于干眼发病机制与炎症相关，抗炎治疗成为一个重要的治疗手段。在国际干眼工作小组（）的报告中，皮质类固醇激素和环孢霉素被认为是治疗干眼的有效药物。重度干眼患者的眼部炎症和免疫反应在治疗后可得到显著改善。但是，由于其相对过度的疗效和潜在的副作用，皮质类固醇激素和环孢霉素的价值对于轻中度干眼患者存在局限性。因此临床上对于轻中度的干眼患者来说需要寻找一种更少的副作用、更少刺激并具有适中的抗炎效果的新治疗方法。
由于非甾体类抗炎药（NSAIDs）具有非选择性地抑制环氧合酶1和2（COX-1，COX-2）的抗炎功能11-13，其局部给药广泛用于眼表疾病如术后感染预防、葡萄膜炎和表层巩膜炎。普拉洛芬（PRA，普南扑灵，千寿制药有限公司，日本），一个常用的NSAID，是具有三环结构的丙酸化合物，已经证明对过敏性结膜炎及慢性结膜炎具有治疗效果14,15。在我们之前苯扎氯铵诱导的动物干眼模型的研究结果显示，普拉洛芬通过降低TNF-α在角膜上皮的表达水平以及延长泪膜破裂时间（TBUT）来缓解干眼，其效果与0.1%氟米龙相当11-13。
基于PRA可能会对干眼具有的治疗效果，本研究的目的是评价0.1%普拉洛芬治疗干眼的临床疗效。
方法实验设计
本研究是一个多中心、随机、对照、平行的临床研究，由4个星期的治疗和1个星期的随访组成。本研究在中国7个临床研究点进行。研究方案遵循赫尔辛基宣言、药物临床试验管理规范、知情同意规范以及中国有关临床试验研究规范。
患者选择
患者入组标准：成年患者，性别不限，诊断为具有轻度至中度的干眼症状，并符合以下标准：（1）具有干涩、灼烧、异物感、眼部不适或视疲劳中至少一项眼部症状；（2）任一个眼的无麻醉的泪液分泌试验（ST1）2mm/5min并且≤5mm/5min；（3）单眼角膜角膜荧光素染色评分（FLCS）合计为2-6分；（4）单眼TBUT在2-5秒之间。在研究中不允许患者使用其他局部眼表治疗药物。
患者排除标准：对研究药物中任何成分过敏者；孕妇或哺乳期女性；真菌、细菌或病毒性角、结膜炎活动期患者；患有严重的心脏、肺、肝脏或肾脏第一个干斑出现的持续时间。
患者排除标准：对研究药物中任何成分过敏者；孕妇或哺乳期女性；真菌、细菌或病毒性角、结膜炎活动期患者；患有严重的心脏、肺、肝脏或肾脏疾病；在研究前有不能治愈的眼疾；近6个月内有眼部手术；在研究中不愿意停止佩戴角膜接触镜；同时加入另一个临床研究；近24小时内使用了影响本临床研究的滴眼液；不能够根据研究规定完成本研究；以及严重的系统疾病或Sjoren’s综合征。如果患者出现副反应、妊娠、违反协议、没有效果、没有给药或其他个人问题，在研究完成前可以停止试验。
研究方案
要求符合条件的患者签订知情同意表格，并将患者随机分配使用0.1%普拉洛芬（PRA）联合0.1%玻璃酸钠（SH）或只用0.1%SH进行治疗，每日3次。要求患者在第7、14、28医院从而进行评价。
在第0、28天对使用PRA治疗的患者进行印迹细胞学（IC）检查。将孔径为0.2μm的醋酸纤维素滤膜（ADVANTEC，CAA，ToyoRoshiKaisha,Ltd.，日本）切成直径为6mm的切片。在局部给予0.5%的盐酸丙对卡因对眼睛进行麻醉后，通过压住无齿手术镊的钝端3-5秒从而将滤膜敷于上球结膜上，然后将其从结膜上轻轻取下，换用另一个无齿手术镊并将其置于无核糖核酸酶的1.5ml离心管中，该离心管中含有μl的细胞裂解液（RNApreppureMicroKit，DP，RIANGEN，德国）和3.5μl的2-巯基乙醇（Gibco，-，美国）。样本储存在-80℃的冰箱中。收集后，所有的IC样本被送到厦门大学的眼科学院进行定量实时聚合酶链反应（RT-PCR）测定。
结果测定
疗效
干眼症状通过填写干眼症状评分表格（DESS）评估。干眼症状的评价包括TBUT、FLCSHE和无麻醉的ST1。基线和每次随访时记录所有这些变量。
DESS由包括干涩、灼烧、异物感、眼部不适和视疲劳在内的五个问题组成。眼部症状的严重程度被评定为一个4级的范围，从0到3依次为：0，没有症状；1，偶然；2，持续但不影响生活质量；3，持续并影响生活质量。总分为0-15。
TUBTs的测定是在用生理盐水润湿后，通过将荧光条敷于双眼下穹隆的方式进行。叮嘱患者眨眼三次，分别计算三次从最后一次眨眼到染色泪膜上。
FLCS评分分四个象限：颞上方、颞下方、鼻上方及鼻下方。每个象限的角膜荧光素染色评分采用标准的3分制：0分，无角膜荧光素染色；1分，荧光素染色点小于等于5个，无融合；2分，荧光素染色点大于5个，无融合。3分，角膜出现融合荧光素染色区。
ST1试验时不进行麻醉。将滤试纸条轻轻放入下结膜囊的中外1/3处，在病人闭眼直视前方5分钟后取出滤纸，测定泪液体积。
安全性
PRA的主要安全性问题是药物刺激性，其严重程度通过与DESS类似的方法评估，共4个等级。其他安全性变量通过最佳矫正视力，眼压及活检（不散瞳的裂隙灯检查）评估。所有患者都评价安全性。
RT-PCR
总RNA通过使用微量样品总RNA提取试剂盒从印迹细胞学样品管提取（DP，天根，中国），20μlcDNA通过一个商业购买的第一链cDNA合成方法产生。基因扩增以及HLA-DR和ICAM-1的检测通过ABI系统（Biosystems，美国）进行。靶mRNA的归一通过β-肌动蛋白mRNA进行。HLA-DR（序列号：5’-TGACAAGCCCTCTCACAGTGGAA-3’；反序列号：5’-TGGCTGAAGTCCAGAGTGTCCTTT-3’），ICAM-1（序列号：5’-TGTGGTAGCAGCCGCAGTCATAAT-3’；反序列号：5’-CGTGGCTTGTGTGTTCGGTTTCAT-3’），β-肌动蛋白（序列号：5’-CCCTGTGCTGCTCACCGA-3’；反序列号：5’-ACAGTGTGGGTGACCCCGTC-3’）。聚合酶链锁反应两步法的温度设置为：预变性95℃10分钟，45循环95℃15秒、60℃1分钟。
统计学分析
数据都以平均值±标准差（SE）显示并通过SPSS13.0（SPSS，芝加哥，美国）进行分析。多元方差分析（ANOVA）用来比较两组间的疗效。研究地点、个体以及年龄被认为是随机影响，而普拉洛芬治疗和时间被认为是固定影响。为了进一步验证ANOVA的结果，每次随访时都对各临床指标进行LSD检验。治疗前后HLA-DR和ICAM-1的mRNA水平的改变用的是维尔克松轶和检验。P0.05认为具有统计学差异。
结果患者随访及流行病学
位患者参加了本项研究，有16位在研究结束前脱落。位患者完成了本研究，55例患者试验组和60例对照组（表1）。所有患者均为汉族。
疗效分析
总的来说，基线是两组间DESS，FLCS，TBUT及ST1无显著性差异（表2）。FLCS和TBUT相对于基线的平均改变量显示了治疗期PRA联合SH治疗相较于单用SH有显著的改善，在第14天使具有在28天时，两组间DESS和ST1（P=0.和0.，图1C和1D）。
表1患者随访及流行病学
PRA+SH
SH
性别
男
女
年龄（岁）
≧60
≧40且≦59
≦40
FLCS亚组（评分）
≧1且≦3
≧4且≦6
14
41
11
30
14
38
17
13
47
12
24
24
41
19
表2总体及亚组各指标的基线值
组
PRA+SH
（n=55）
SH
（n=60）
总体患者
DESS
FLCS
TBUT
ST1
FLCS1-3亚组
DESS
FLCS
TBUT
ST1
FLCS1-3亚组
DESS
FLCS
TBUT
ST1
6.51±0.42
2.89±0.17
2.64±0.13
5.30±0.66
6.16±0.48
2.18±0.11
2.55±0.14
5.12±0.79
7.29±0.80
4.47±0.21
2.82±0.27
5.69±1.23
6.48±0.40
2.88±0.19
2.75±0.10
4.56±0.59
6.67±0.51
2.02±0.09
2.64±0.12
3.66±0.42
6.06±0.60
4.89±0.21
3.00±0.20
6.64±1.65
PRA+SH：0.1%普拉洛芬联合0.1%玻璃酸钠。SH：0.1%玻璃酸钠。各亚组患者人数：FLCS1-3亚组PRA+SH组38人SH组41人；FLCS4-6亚组PRA+SH组17人SH组19人。
图1各临床指标PRA联合SH用药的效果。A：角膜荧光素染色（FLCS）相对于基线的平均改变量B：泪膜破裂时间（TBUT）相对于基线的平均改变量C：干眼症状评分（DESS）相对于基线的平均改变量D：Shirmer1试验（ST1）相对于基线的平均改变量。数据均表示为均值±标准差（SE）。相较于0.1%玻璃酸钠组，*表示P0.05，?表示P0.01。
图2亚组患者PRA联合SH用药的效果。A：治疗28天后FLCS1-3分亚组相各变量对于基线的平均改变量B：治疗28天后FLCS4-6分亚组相各变量对于基线的平均改变量。数据均表示为均值±标准差（SE）。相较于0.1%玻璃酸钠组，*表示P0.05，?表示P0.01。
另外，按照FLCS评分将患者区分为较轻FLCS（1-3分）和较重FLCS（4-6分）进一步研究了PRA的疗效。基线时，PRA联合SH和单用SH组之间的DESS，FLCS，TBUT及ST1没有统计学差异（表2）。在较重FLCS组，第28天两组间的DESS，FLCS，TBUT具有统计学意义（P=0.，0.及0.，图2B），而两组间的ST1没有统计学意义（P=0.，图2B）。在较轻FLCS组中，两组间的DESS，FLCS，TBUT及ST1没有观察到差异（P=0.，0.，0.及0.，图2A）。
HLA-DR和ICAM-1的基因表达水平
在PRA联合SH治疗28天后，HLA-DR和ICAM-1的表达减少，但仅HLA-DR的减少具有显著性差异（HLA-DR，P=0.；ICAM-1，P=0.，图3）。
安全性分析
PRA联合SH组由10位患者具有短暂的刺激包括轻中度的烧灼感和刺痛感，6位患者（11%）在每次随访时反映有上述不适感。在SH组，5位患者（7%）在每次随访时反映有上述不适感。没有患者因为无法忍受的刺激感和严重的副作用退出研究（表3）。
表3研究期间的副作用事件
PRA（n=55）
SH（n=60）
副作用事件
一过性
持续性
副作用引起的脱落
16（29）
10
6
0
5（8）
0
5
0
数据显示为n或者n（%）
讨论本研究证明了轻中度症状的干眼使用PRA联合SH治疗28天能够显著改善FLCS和TBUT。整个治疗期能观察到DESS的改善具有时间依赖性。极少数患者使用PRA后具有短暂的刺激，但是不影响长期的及时给药。两组都认为具有良好的耐受性且没有严重的副作用。
干眼患者的COX-2的表达水平以及其产物前列腺素E2（PGE2）显著增加16。COX-2是环氧合酶（COXs）的一个异构体，常表达于眼部组织17。COX-2的过表达会产生过多的内源性前列腺素如PGE2进入到泪液和眼表，在炎症早期便能够在局部诱导并激活白细胞、巨噬细胞和肥大细胞18,19。作为一种NSAIDs，PRA通过非选择性抑制COX1/2来抑制PGs合成的抗炎效果为大家熟知。在使用PRA联合SH治疗的患者中，治疗期间FLCS逐渐降低，与对照组相比在第14天和第28天时显著降低（图1A）。角膜上皮缺失可以很好的反应眼表炎症严重程度，因此提示我们PRA给药至少2周可以通过它的抗炎效果有效恢复眼表上皮的完整性。
PGE2除具有炎症介质作用外，还被认为能够直接激活伤害感受器从而导致痛觉增敏以及间接刺激痛觉相关神经肽如物质P（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）20-22。PRA通过抑制眼表PGE2的产生来减轻痛觉增敏并有着镇痛的作用，因此，至少存在部分PGs相关眼表炎症的患者正好充分发挥PRA的疗效（图2）。同时，NSAIDs给药还可以通过立体选择性干扰G蛋白介导的信号通路来独立地抑制前列腺素的合成，从而减轻疼痛23。然而，有关干眼相关的症状及其与NSAIDs的关系仍然需要更多的研究。
使用PRA联合SH治疗的患者在治疗期间也观察到TBUT的稳步改善。TBUT的变化被认为是眼表微环境对外界压力的敏感指标，很容易被上皮细胞凋亡，杯状细胞确实，粘蛋白/脂质的非正常分布等影响24。泪膜稳定性的修复被认为是炎症减轻后的结果，提示PRA的抗炎治疗部分阻制了干眼的恶性循环，通过修复眼表的细胞功能如粘细胞和杯状细胞，帮助重建健康的微环境。
HLA-DR和ICAM-1是两个在眼表广泛表达、相互作用的分子，被证明在干眼患者的眼表高表达并且在干眼好转时减少25-28。虽然跟激素相比，NSAIDs的抗炎和免疫抑制的效果具有局限性，NSAIDs仍然拥有自己的免疫调节机制。COX-2mRNA在静止的人T淋巴细胞内表达水平较低，但在T细胞激活早期表达水平会迅速增加。同时，COX-2诱导生成的PG产物被认为能够在T细胞激活后期促进持续NF-AT的激活。选择性的NSAIDs不仅能抑制T细胞的增殖，CD25和CD71的表达，IL-2，TNF-α和IFN-β，还能通过抑制MAPK途径以及特有的p38活化29,30来抑制NF-AT的活性。在本研究中，PRA治疗后HLA-DR和ICAM-1的表达水平降低且HLA-DR的改变具有显著性差异，与刘等人的研究结果一致31。虽然激素和环孢素在治疗重度或免疫相关的干眼如干燥综合症仍然具有无可比拟的优势，但PRA凭借其抗炎作用温和，眼部刺激弱，副作用较小等特点，将会是轻中度干眼治疗中替代局部应用环孢素或激素的一个很好的选择32,33。
参考文献温馨提示：可登陆干眼网、医信眼科网站查看PDF版本文献。
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